中药治疗皮肤瘢痕增生的现代研究进展 赵庆利、蔡瑞康 关键词：皮肤、细胞学、瘢痕、药物疗法 皮肤瘢痕增生在临床上分为两种类型，增生性瘢痕与瘢痕疙瘩。两者均表现为瘢痕组织过度增生、凸出皮面；前者瘢痕局限于原发损伤处，后者瘢痕呈侵袭性生长，累及周围正常皮肤。成纤维细胞的过度增殖、凋亡抑制、合成胞外基质的功能增强，以及胞外基质中胶原的合成与降解失衡均可导致胶原纤维的过量沉积，这些构成了皮肤瘢痕增生的生物学基础。 祖国医学对瘢痕增生的治疗历史悠久，并积累了丰富的经验。近年来，国内学者采用现代研究手段探讨中药治疗皮肤瘢痕增生的作用机制。 研究途径主要通过细胞培养及动物实验，实验对象多选择增生性瘢痕或瘢痕疙瘩成纤维细胞及李荟元等建立的兔耳瘢痕动物模型，实验用药多为单味中药的注射针剂及中药提取的活性成分粉剂，并以药物的不同浓度、不同作用时间以及不含药物对照进行实验分组。现将检测方法及研究结果综述如下。 1中药对成纤维细胞的影响 1.1中药对成纤维细胞形态及超微结构的影响 采用倒置显微镜对体外培养细胞进行动态观察是成纤维细胞形态学研究中最常用的手段，还可将培养细胞染色并在光电镜下观察。近年来的研究表明，多种中药如丹参、川芎嗪、积雪草甙、苦参碱、汉防己甲素、三七总甙可使瘢痕成纤维细胞梭形突起回缩，甚至呈球形，部分贴壁细胞脱落、悬浮；积雪草甙、苦参碱、五倍子、蜈蚣可使瘢痕成纤维细胞胞浆内粗面内质网疏松、减少，部分核蛋白体脱颗粒，核染色质边集于核膜周边，还可见到核分裂相减少，核仁细小或缺失，细胞器减少，线粒体空泡变性，自噬溶酶体增多等表现。这些说明了药物可能干扰成纤维细胞的正常生理功能。 将中药反复多点注射于兔耳瘢痕组织中，然后将组织切片、染色并在光电镜下观察，结果发现丹参、粉防己碱可使成纤维细胞数量减少、排列规整，胞浆内粗面内质网疏松、减少，部分核蛋白体脱颗粒，核染色质浓缩集聚至核膜周边。这表明药物可使成纤维细胞的增殖呈抑制状态，使其合成和分泌蛋白的活性减弱。 1.2中药对成纤维细胞增殖及活力的影响 检测中药作用后的成纤维细胞体外增殖常用两种方法，将细胞经苔盼蓝染色后计数或采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。二者实际上是检测细胞的存活状况。尚有作者在光镜下直接计数成纤维细胞，或将成纤维细胞染色后计数有丝分裂细胞数、有核分裂细胞数，或针对增殖细胞核抗原进行免疫组织化学染色，或采用流式细胞术。 大量的研究表明，丹参、丹参酮ⅡA、川芎嗪、积雪草甙、粉防己碱、汉防己素、苦参碱、三七总甙、五倍子、鸦胆子对瘢痕成纤维细胞的体外增殖及活力具有抑制作用，并随着药物浓度的增加及（或）作用时间的延长而抑制作用增强。 沈丹蓓等观察到红花、蜈蚣对瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用轻微，其抑制作用无剂量依赖关系，而任丽虹等却发现蜈蚣能明显抑制瘢痕成纤维细胞的增殖，其抑制作用与剂量和时间有关。有作者发现，正常皮肤与瘢痕成纤维细胞对中药的反应不同。沈丹蓓等报道五倍子对瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用较对正常皮肤的作用强。沈雁等报道鸦胆子1.90μg/ml、15.6μg/ml可以分别抑制瘢痕成纤维细胞、正常皮肤成纤维细胞增殖，二者的IC50值分别为37.8μg/ml、42.2μg/ml。 1.3中药对成纤维细胞DNA合成的影响 胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。将同位素3H标记的TdR掺入到细胞培养液中并测定其放射性强度，即可判断DNA的合成量。研究表明，丹参、川芎嗪、粉防己碱能明显地抑制瘢痕成纤维细胞的体外3H-TdR掺入，并随药物剂量的增加而抑制作用增强。 李宇明等观察到消瘢醑（主要由白花蛇舌草、生半夏、半枝莲、苦参、丹参、赤芍及莪术组成）可抑制瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的3H-TdR掺入。谢举临等发现，随着积雪草甙浓度的增加，瘢痕成纤维细胞的3H-TdR掺入下降，呈剂量效应关系。而王瑞国等的研究结果却相反，该作者发现随着积雪草甙浓度的增加，新生小白鼠皮肤成纤维细胞的3H-TdR掺入呈剂量依赖性升高。 1.4中药对成纤维细胞的细胞周期及DNA相对含量的影响 细胞周期是指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，包括G1期（DNA合成前期/复制前期）、S期（DNA复制期）、G2期（合成后期）和M期（有丝分裂期）。G0是指两次增殖周期之间的间期。目前，研究者多采用流式细胞仪测定体外培养的成纤维细胞周期。 研究发现，丹参、川芎嗪、积雪草甙、苦参碱等可影响瘢痕成纤维细胞周期，但研究结果却不尽相同。部分结果显示药物可重点作用于增殖期，或为G2期，使滞留于G2-M期的细胞比例增加，干扰有丝分裂前的准备，阻碍有丝分裂的进行；或为S期，使S期细胞减少或时相延长，细胞DNA的合成受到抑制；或两者兼而有之，同时干扰细胞的DNA合成及有丝分裂。 刘流等观察到丹参使增殖期（S-G2-M）细胞百分数明显减少。商庆新等发现丹参可使G2-M期细胞分布增多，G2-M期延长，G0-G1期细胞相对减少，细胞周期受阻于G2期。陈明春等观察到积雪草甙及苦参碱可使细胞G2-M期比例增加。汤苏阳等发现苦参碱使S期细胞显著减少。商庆新、曹治东等分别报道川芎嗪、汉防己甲素均能使G2-M期细胞增多，G2-M期及S期延长。部分结果则显示药物可阻止瘢痕成纤维细胞进入S期，使静止期细胞增多。如雷水生、汤苏阳等分别发现川芎嗪、苦参碱使G0+G1期细胞的百分比显著增高，G2+M期细胞的百分比显著降低。张培华等观察到芦荟大黄素可使G1期细胞数量增加，S期和G2期细胞数量减少，并呈浓度依赖性或时间依赖性关系。 DNA相对含量（DI）是衡量细胞是否为二倍体的一个指标。在正常二倍体细胞中DI值为1.01±0.01。当DI>1.1表示细胞为异倍体、有畸变。研究显示，中药如丹参、川芎嗪、积雪草甙、苦参碱在一定浓度、一定作用时间内对成纤维细胞DI的影响不明显，即无论药物作用与否，成纤维细胞均为二倍体细胞，无变异发生。 1.5中药对成纤维细胞凋亡的影响 对成纤维细胞凋亡的检测主要采用流式细胞术及形态学鉴定，后者包括原位末端标记法及Hoechst33258与碘化丙啶（PI）双染法。原位末端标记法是基于对细胞凋亡分子机制的认识，用TdT将生物素化的dUTP标记至3-羟基末端，再用免疫组织化学方法使阳性细胞显色。此方法可发现早期的凋亡细胞，具有较高的灵敏性。 Hoechst33258为特异性荧光染料，它能以非嵌入式结合在DNA的碱区。采用Ho-echst33258与PI双染法检测凋亡细胞具有较高的特异性。 近年来的研究表明，多种中药可诱导体外培养的瘢痕成纤维细胞发生凋亡。左强等发现经丹参酮ⅡA作用后，出现凋亡小体的成纤维细胞明显增多，其凋亡指数呈剂量依赖性。陈明春等观察到积雪草甙、苦参碱可迅速地诱导大量的成纤维细胞发生凋亡，并随着作用时间的延长而凋亡率显著升高。钟晓春发现粉防己碱可使成纤维细胞的凋亡率显著高于对照组。张培华等观察到经芦荟大黄素处理的成纤维细胞24h后出现“亚二倍体峰”即凋亡峰，随着作用时间的延长，亚二倍体峰百分数增多，即芦荟大黄素以时间依赖性的方式诱导成纤维细胞发生凋亡；作者同时采用上述3种检测手段证实，芦荟大黄素呈量效关系促进成纤维细胞发生凋亡。 Survivin是一种凋亡抑制蛋白，它可通过多种调控机制而发挥强大的抗凋亡作用。雷晓红等在检测丹参对瘢痕成纤维细胞体外凋亡影响的同时检测SurvivinmRNA水平及Survivin蛋白的表达。结果显示丹参 核转录因子NF-κB是调节细胞生长及凋亡的重要因子。抑制NF-κB的活性可诱导细胞发生凋亡。姜会庆等同时检测丹参素作用后的人皮肤成纤维细胞的NF-κB结合活性及细胞凋亡，发现经丹参素作用后，NF-κB结合活性几乎被完全抑制，成纤维细胞发生凋亡，这表明丹参素可能通过抑制成纤维细胞核转录因子NF-κB的活性而诱导其发生凋亡。 1.6中药对成纤维细胞的毒性作用 乳酸脱氢酶（LDH）为所有细胞胞浆内存在的细胞内酶。一旦细胞膜受损，LDH即可迅速释放至细胞外，故它可作为细胞毒性检测的敏感指标。在以往的研究中，多数学者发现经中药如川芎嗪、苦参碱处理后，瘢痕成纤维细胞培养上清中LDH活性无明显增高，即药物对成纤维细胞无损伤作用。而陈明春、雷晓红、兰海等却观察到低浓度丹参、川芎嗪、积雪草甙作用于瘢痕成纤维细胞后，培养上清中LDH与对照组比较无显著差异；当丹参浓度达 2中药对胶原代谢的影响 羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，脯氨酸又可在羟化酶的作用下转化为羟脯氨酸，故羟脯氨酸比色法及3H-脯氨酸掺入法可准确地反映胶原蛋白的合成。近年来，许多研究者采用免疫组织化学技术及分子杂交技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。 大量的研究证明，丹参、川芎嗪、积雪草甙、苦参碱、粉防己碱、汉防己甲素、五倍子、蜈蚣及三七总甙均能抑制体外培养的瘢痕成纤维细胞合成胶原蛋白，并且随着药物浓度的增加及（或）作用时间的延长，中药对胶原蛋白合成的抑制愈强，即呈剂量及（或）时间依赖关系。 刘德伍等观察到粉防己碱在不抑制瘢痕成纤维细胞DNA合成的药物浓度时即可显著抑制其胶原合成。曹治东等发现汉防己甲素对瘢痕成纤维细胞的杀伤率与对胶原蛋白量的抑制率呈直线正相关。 动物实验研究表明，经丹参、丹参酮ⅡA局部注射后，兔耳增生性瘢痕组织中胶原纤维致密性下降，胶原染色淡而疏松。增生性瘢痕与瘢痕疙瘩的胶原组织主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原组成，与正常皮肤比较，两者Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显增加。近年来的研究发现，某些中药影响着Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成，有些是通过对前胶原基因转录水平的影响而实现的。 张涛等发现经积雪草甙治疗的增生性瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量较少，排列整齐，与非积雪草甙组比较差异显著，而Ⅲ型胶原在两组间的表达无显著性差异。李万同等观察到瘢痕成纤维细胞经汉防己甲素作用后Ⅰ型胶原蛋白荧光强度减弱，并呈剂量依赖关系。黄辉等报道瘢痕成纤维细胞经消瘢醑处理后Ⅰ、Ⅲ型胶原染色强度明显下降，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白合成抑制率分别为30.7%、5.1%。雷晓红等观察到当丹参浓度为 成纤维细胞合成分泌胶原蛋白受核转录因子NK-1的调控，当NK-1被激活时便结合在前胶原基因的启动子上而诱导前胶原基因的转录与表达。姜会庆等发现丹参素可使人皮肤成纤维细胞NK-1结合活性降低近50%，Ⅰ型前胶原α1和α2的mR-NA水平分别降低56%和59%。这表明丹参素可能通过抑制成纤维细胞核转录因子NK-1的活性而调控胶原的合成与分泌。基质金属蛋白酶-1（MMP-1）是降解Ⅰ型胶原蛋白的关键酶，在烧伤后增生性瘢痕的形成过程中MMP-1的表达降低。李万同等观察到，经汉防己甲素处理过的瘢痕成纤维细胞培养上清液中MMT-1增加，成纤维细胞的MMP-1mRNA表达增加，均呈剂量依赖性，这表明汉防己甲素可能通过增加MMP-1mRNA转录、增加MMT-1合成而减少Ⅰ型胶原蛋白。 3中药对细胞因子的影响 来自创伤局部的多种细胞分泌的细胞因子如转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）等可影响成纤维细胞的增殖及功能活性。部分中药可通过干预细胞因子的分泌而影响成纤维细胞的生物学性状。 如刘德伍等发现，加入巨噬细胞培养上清介质可诱导瘢痕成纤维细胞的3H-TdR掺入，加入低于有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖剂量的粉防己碱后，由巨噬细胞培养上清介质介导的3H-TdR掺入受到明显地抑制。这表明粉防己碱可阻断细胞因子的促瘢痕成纤维细胞增殖作用。 在众多与皮肤瘢痕增生有关的细胞因子中，TGF-β最为重要、最具有代表性。TGF-β1、TGF-β2可促进瘢痕增生，TGF-β3可抑制瘢痕增生。其中TGF-β1可通过Smad3，7mRNA/AP-1信号途径和基质金属蛋白酶（MMPS）/金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPS）途径来调节Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成。而MMPS是调节细胞外基质动态平衡的最重要的一大酶系，对细胞外基质有广泛的降解作用。 王益民报道丹参可抑制体外培养的正常皮肤成纤维细胞自分泌TGF-β1，且随丹参浓度的增加及作用时间的延长，TGF-β1降低愈明显。姚恒等发现经过三七总甙作用后，瘢痕成纤维细胞胞浆内的TGF-β1染色颗粒色弱、量少。张涛等观察到经积雪草甙治疗的增生性瘢痕中TGF-β1mRNA、TIMP1表达明显减少，TGF-β3mRNA表达明显增多，与非积雪草甙治疗组比较均有显著性差异，而MMP1、MMP2及TIMP2在上述两组中表达无显著性意义。这表明积雪草甙可通过降低TGF-β1mRNA表达和增加TGF-β3mRNA的表达，引起TIMP1表达明显减少，MMP1/TIMP1相对比例增加，从而达到促进Ⅰ型胶原降解，减轻瘢痕增生的作用。 Smad蛋白家族是近年来发现的TGF-β受体下游信号蛋白，它可将TGF-β受体激活后的信号从胞浆传递到细胞核内的靶基因。其中Smad2可转导TGF-β信号，Smad7可抑制信号转导。潘姝等观察到瘢痕成纤维细胞经过积雪草甙作用后，Smad2免疫阳性颗粒、蛋白含量及Smad2mRNA相对表达与对照组比较无显著差别，Smad7免疫阳性颗粒、蛋白含量及Smad7mRNA相对表达则显著增加。提示积雪草甙可能通过增加成纤维细胞中抑制性Smad7基因表达而发挥抑制瘢痕增生作用的。 PDGF是影响皮肤瘢痕增生的另一个重要因子，它可与成纤维细胞膜表面受体结合，激活受体酪氨酸激酶产生有丝分裂信号，导致DNA合成及成纤维细胞增殖；同时PDGF还可刺激成纤维细胞表达TGF-β，诱导胶原合成增加。刘德伍等在体外培养的瘢痕成纤维细胞中加入PDGF、TGF-β、粉防己碱，发现PDGF单用及与TGF-β联合应用均可明显地促进成纤维细胞的DNA合成，粉防己碱单用对细胞的DNA合成无明显影响，但却显著地抑制PDGF及PDGF+TGF-β诱导的成纤维细胞DNA合成。 4中药对其他方面的影响 在兔耳增生性瘢痕中注射丹参酮ⅡA、丹参或川芎嗪，28d或40d后切取瘢痕及周围正常组织测量并计算瘢痕增生指数（HI）。吴志远等设耳腹侧正常皮肤厚度为a、耳软骨厚度为b、耳背皮肤厚度为c、耳增生块全厚度最大径为d，HI为[d-（b+c）]/a；苏毅鹏等设瘢痕面积与瘢痕及其覆盖的软骨的总面积之比为HI。结果显示丹参酮ⅡA可抑制瘢痕组织增生，HI随药物浓度的增加而减少；丹参组、川芎嗪组HI降低，与生理盐水组比较差异有显著意义。 刘德伍等采用成纤维细胞三维培养方法，即将人瘢痕成纤维细胞与仔猪猪皮胶原等混匀培养形成凝胶块，以观察粉防己碱的抗收缩效应。设D为凝胶块最大与最小直径的均数，D0为凝胶块初始直径，凝胶块收缩指数CI为[1-（D/D0）2×100%]。 结果显示单纯加入粉防己碱及同时加入TGF-β及粉防己碱后，凝胶块的CI均降低，并呈剂量依赖关系。这表明粉防己碱能有效地抑制体外瘢痕成纤维细胞与胶原基质网的收缩，对TGF-β的促瘢痕基质收缩具有阻断作用。 陈远征等将瘢痕膏（主要成分为丹参酮、积雪甙、黄芩甙、甘草酸及苦参碱等）涂抹于兔耳增生性瘢痕处，采用激光多普勒血流仪测瘢痕组织微循环血流灌注，采用免疫组织化学染色及光镜下计数测微血管数量，结果显示瘢痕膏组血流灌注值及微血管计数均明显低于基质对照组。 目前，关于中药治疗皮肤瘢痕增生机制的研究仍十分有限，研究药物仅为少数几种单味药及提取的活性成分，研究内容多局限于中药对成纤维细胞生物学性状的影响，研究水平多停留在生化、细胞水平。皮肤瘢痕增生的形成机制比较复杂，而中药对机体的作用又为一复合效应。因此，在研究中不容忽视中药的综合作用，同时需借助现代医学的新技术从分子、基因水平上进行深入地探索，以期早日解决皮肤瘢痕增生这一难题。 参考文献：略 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