抗衰老化妆品体外细胞水平上功效评价方法研究进展 郭松鹤、高合意、曾飒、张革 摘要：从角质形成细胞模型抗衰老功效评价方法、成纤维细胞模型抗衰老功效评价方法以及三维皮肤模型抗衰老功效评价方法３方面，综述了抗衰老化妆品体外细胞水平上功效评价方法。在培养的角质形成细胞、成纤维细胞及三维皮肤模型上对化妆品有效成分进行细胞学观察及关键指标分子生物学检测，这些技术对抗衰老产品的功效评价和研发具有广泛的应用价值。 关键词：抗衰老化妆品；细胞模型；功效评价 随着经济的迅速发展和人们生活水平的提高，抗衰老化妆品越来越受到重视，同时消费者的消费观念也在趋于理性化，对化妆品的护理功效和安全性的要求逐渐提高。许多化妆品企业和研究机构投入大量的人力、物力进行新型产品的研发，添加新的抗衰老成分的化妆品越来越多。 一般认为，抗衰老化妆品的功效包括减缓皮肤中水分的散失，保护皮肤，增强皮肤抗氧化能力，提高细胞增殖速率等。近年来，随着生物医学技术在医药、食品等领域的快速发展和“动物替代实验”理念的推广，体外细胞水平评价已成为检验化妆品功效的有效手段之一。 鉴于此，笔者从角质形成细胞、成纤维细胞及三维皮肤模型等方面对抗衰老化妆品体外细胞水平上功效评价方法进行介绍。 １角质形成细胞模型抗衰老功效评价方法 １.１角质形成细胞模型 角质形成细胞（Keratinocytes Kc）是人体表皮中的主体细胞成分。Kc经过增殖和分化，最终形成包括基底层、棘层、粒层及角质层的表皮复层结构。从婴幼儿或成人皮肤中原代分离培养人表皮角质形成细胞（Human Epidemal Keratino,HEK）技术已经成熟，经免疫组化进行角蛋白、层粘连蛋白等多种HEK特征性蛋白表达等鉴定后即可传代备用，原代HEK在医学上已经被广泛用于皮肤病理学及药理学研究中。 人皮肤永生化角质细胞HaCaT是非肿瘤来源的永生化人正常皮肤HEK细胞株，较之ＨEＫ易于培养及传代。传代的HaCaT与正常ＨEＫ分化特性相似，在医学研究中被用作正常ＨEＫ的代替细胞。目前HaCaT细胞株已被广泛应用于化妆品的抗衰老及透皮性的研究中。 １.２Kc抗衰老保湿相关蛋白的检测 Kc合成的与表皮保湿相关的生物分子主要有水通道蛋白（Aquaporin，AＱP）、紧密连接蛋白（Tightjunctionprotein，TJP）和透明质酸（Ｈyaluronicaciｄ，ＨA）等。AＱP是一种位于细胞膜上的蛋白质，能显著增加细胞膜对水分子的通透性。由于表皮层没有血管，表皮层中的水分都是从真皮中扩散而来，因此，表皮细胞间的AＱP就构成了细胞间水分输送的主要通路。 迄今为止已发现13种AＱP，其中AＱP３是人皮肤中表达量最丰富的水通道蛋白亚型，AＱP3除对水分子通透外还对甘油等具有通透性。目前主要采用ＷesternBlot杂交、免疫组化染色法半定量检测以及商品化试剂盒ELISA法定量检测AＱP3含量的变化，可以作为化妆品保湿功效有效成分的评价指标之一。 颗粒层的紧密连接结构是皮肤屏障的最后一道防线，TJP控制水分通过细胞旁途径进入颗粒层，在维护皮肤屏障表皮含水量中起到重要作用。TJP主要在颗粒层中的角质细胞内表达，其相互缠绕组成蛋白颗粒，在细胞表面重复排列，形成连续的纤维，将相邻细胞连接起来，使大分子物质难以透过，而水分子也只能从纤维衔接处的小孔中缓慢透过。 对皮肤保湿起重要作用的TJP有紧密连接蛋白（Claudin-1）和闭锁连接蛋白（Zonulaoccludens，ZO-1）等，Clauｄin-1在整个皮肤上皮层表达；ZO-１在角质细胞层连接处表达。采用ＷesternBlot杂交及免疫组化染色法半定量检测ＴＪP（ZO-1和Clauｄin-1）的变化，或商品化试剂盒ELISA法定量检测Claudin-1对保湿功效进行评价。 ＨA是有保水功能的葡聚糖醛酸聚合物。真皮组织含水量与ＨA含量有直接关系。在机体的器官中皮肤的ＨA含量最高，占人体全部ＨA的50％。如今ＨA作为化妆品成分用于保养皮肤倍受重视，被公认为最佳保湿成分。ＨA能使水分进入细胞间隙，并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶，将细胞粘在一起，发挥正常的细胞代谢作用，起到保持细胞水分的作用。ＨA的检测方法有多种，但采用商品化试剂盒ELISA法或免疫化学发光法定量检测ＨA更精确，也更适用于化妆品评价。 ２成纤维细胞模型抗衰老功效评价方法 ２.１成纤维细胞模型 人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblast，HSF）是人体皮肤真皮中的主体细胞成分，它与自身分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮主体。HSF除合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子外，同时还有趋化性和粘附性，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，HSF的数量减少是引起皱纹产生的重要原因。 已有大量的研究证明HSF因特有的生物学性能改变，在皮肤老化过程中扮演着重要角色。目前从胎儿或儿童皮肤中分离培养原代HSF相关技术已成熟，经免疫组化进行特征性波形蛋白（Vimentin）或胶原表达鉴定后，即可以体外传代培养备用，HSF已应用于化妆品的筛选和初步评价研究中。 ２.２HSF体外增殖及修复能力检测 真皮中HSF的数量及活力均会影响胶原蛋白的分泌、胶原蛋白纤维的数量以及胶原蛋白纤维束构造。胶原蛋白降解与合成失衡、胶原纤维减少或构造紊乱会导致皮肤失去弹性并形成皱纹。 在皮肤老化的研究中，HSF体外增殖能力已经得到广泛研究，并且成为研究皮肤老化的重要工具，可以通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法对HSF的体外增殖能力进行检测。HSF生长因子是其增殖最有效的刺激因子，可以作为实验的阳性对照，评价化妆品是否有效刺激HSF增殖。 正常成人皮肤中HSF分泌的胶原主要以Ⅰ和Ⅲ型为主。其中Ⅰ型胶原是构成正常成人皮肤的主体，而正常胎儿皮肤主要由Ⅲ型胶原组成。胶原蛋白是细胞外基质中最活跃的成分之一，是创面愈合和瘢痕形成的关键因素，在皮肤功能修复中起重要作用。胶原含量的测定有多种方法，通过ELISA法和Ｗestern Blot杂交可分别精确定量体外培养的HSF分泌及细胞本身Ⅰ和Ⅲ型胶原含量的变化。 ２.３HSF抗衰老活力检测 活性氧自由基（Reactive oxygenspecies，ROS）对皮肤老化起着重要作用，而正常人体细胞每天生化代谢产生大量的ROS。细胞中过氧化物酶发挥了清除ROS的功能，起抗氧化作用。其中超氧化物歧化酶（Superoxidedismutases，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，ＣAＴ）在自由基生成的起始阶段发挥预防性作用，而谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）发挥抗脂质过氧化作用。 通过流式细胞术直接检测HSF内ROS水平的改变、通过比色法检测SOD，CAT和GSH-Px等酶活性的变化，均能灵敏反映出化妆品抗氧化功效。 丙二醛（Ｍalonｄialdehyde，ＭＤA）是脂质过氧化重要产物，在衰老过程中显著累积，与皮肤老年斑（褐脂质）含量呈正相关。ＭＤA还可引起蛋白质的大量异常交联，蛋白质的异常交联也是皮肤老化最重要的原因之一。目前ＭＤA被认为是一种重要的衰老生物标记物，通过ELISA法检测ＭＤA含量变化是比较灵敏的HSF老化评价方法。此外，衰老细胞通常体积变大，溶酶体衰老相关的β-半乳糖苷酶（SABG）酶活性增高。采用免疫组化法观察SABG染色细胞的颜色变化以及用比色法定量ＳAＢＧ活性，可以评估HSF衰老程度的变化。 ３三维皮肤模型抗衰老功效评价方法 ３.１三维皮肤模型 传统二维细胞培养具有易操作、费用低和可大量应用的优点，但细胞呈平面生长无法构建出一个真实立体的微环境，且不能反映出药品或化妆品的透皮性。采用仿真度高的重建人皮肤模型进行化妆品功效及皮肤安全性的研究越来越受到关注。 三维皮肤模型是用于化妆品研究的可用替代法皮肤模型，按照复杂程度分为表皮模型、真皮模型和全层模型３种。表皮模型是将HEK培养在胶原或其他生物材料构成的支架上或由HSF/小鼠成纤维细胞组成的饲养层细胞上；真皮模型将HSF培养在胶原等生物材料构成的支架上；全层皮肤模型主要由表皮层、真皮层和细胞外基质层（含胶原纤维）构成，含分层培养的HEK和HSF。 目前比较常见的是表皮模型，主要用于药品、化妆品和皮肤刺激试验等。如法国SkinEthic公司的人表皮模型SkinEthic，为HEK在聚碳酸酯嵌入式培养皿中培养的重构表皮模型；比利时StratiCELL公司开发的人表皮模型RHE／001，为ＨEＫ培养在聚碳酸酯膜上的重构表皮模型；美国ＭatTek公司开发的EpiDerma为HEK于Millicel嵌入式培养皿中培养后形成的多层、高分化的结构；法国Episkin-SNC公司开发的Episkin是HEK被培养在含有Ⅳ型人胶原蛋白和Ⅰ型牛胶原蛋白（支架）的拟真皮替代物上；EpiKutis为我国开发的ＨEＫ重构表皮模型。 ３.２三维皮肤模型抗衰老功效评价 实验时将活性物质配制成膏霜等剂型，涂于重建皮肤模型上，通过测试相关指标，如清除自由基能力、抗氧化能力和胶原蛋白含量，可以考察化妆品对细胞增殖分化及抗氧化能力的影响。 在三维皮肤模型上评价抗皱剂等的功效性与单层细胞培养相比，更接近于生物体的真实状态，可以用于毒性分析和功效测试，是保证化妆品安全功效的重要手段，如Grazul-Bila等将保湿面霜涂于EpiDerm模型上，进行氧自由基吸收能力的测定。Santa-Ｍaria等用角质细胞模型和重建人表皮模型进行原料测试，结果显示米糠中水溶性酶类具有降低脂质过氧化值的作用。但目前该技术，尤其是研究抗衰老作用的全层皮肤模型存在多细胞共培养技术不成熟、组织结构较简单、各细胞层分化不良以及某些标志物不规则表达的缺点，还需要进一步改进。 随着三维细胞培养技术的发展，三维人造皮肤模型可以在体外培养中模拟人体皮肤构造以及皮肤不同细胞间、细胞与细胞基质间的各种反应，使它更有效地应用于化妆品工业，对于研发人员快速筛选新型功效性原料具有实际意义。 ４结语 建立Kc和HSF模型操作简单快捷，模型用于评价抗衰老化妆品功效可消除不同种属之间的差异，也可确定某一物质引起的生物学反应以及该物质的剂量反应，但是不能更好地反应人体皮肤整体的代谢状况。 三维人造皮肤模型不存在人体差异性问题，也不受人体皮肤代谢状况的影响，恒温恒湿条件下具有一定的稳定性和重复性，除用作皮肤刺激性、光毒性等安全性实验外，还是研究化妆品保湿、抗皱和抗衰老等功效的良好受试体。 将分子皮肤药理学技术和现代仪器分析手段相结合来评价化妆品的综合功效，是未来的发展趋势。因此，化妆品行业在向生物技术、计算机技术等高科技领域渗透的基础上，需要各个领域和学科的协作，才能创建出越来越完善的化妆品功效评价方法。 参考文献：略 |
